HGU
◇ Date: 20000. 00. 00 월요일
◇ Subject : DNAsub-cloning 1단계
◇ Principles
Plasmid: Bacterial cell 내에 염색체와는 독립적으로 존재하며 독자적으로 증식할 수 있는 Circular DNA로 세균의 생존에 필수적인 것은 아니다. Plasmid는 대부분 하나 이상의 유전자를 가지고, 이들 유전자는 종종 Host bacteria에 의해 나
분자 전체의 0.01%에 불과하다. 게다가 10,000형질전환체는 수용세포 배양물에 존재하는 전체 세포 수의 매우 작은 비율이다. 따라서 플라스미드를 uptake한 세포를 구별해야 할 필요가 있다. 이를 위해 선별 마커(selectable marker)를 이용한다. Selectable marker란 비형질전환체(non-transformant)가 가지고 있지 않은 새
1. DNA를 자른다는 것은 nucleotide를 연결하고 있는 phosphodiester bond를 끊어여러 DNA 단편을 만들어 내는 것을 의미한다. 이 때, 이런 역할을 하는 효소를nuclease라고 하며 그 종류로는 바깥 쪽을 절단하는 효소인 exonuclease와 안쪽을 절단하는 endonuclease가 있다.
2. 대표적 endonuclease인 제한효소(restriction enzyme)는
제한효소에 의해 잘린 DNA들을 분리한다.
2. Principle
1) agarose gel electrophoresis 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들
a. DNA분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
b. Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
c. DNA 형태에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA > linear DNA > open circular DNA
d. 전압
◆실험 첫째날 2011년 10월 24일 월요일
▶원리
1 Restriction enzyme 처리
- 이 실험에서 우리는 아무 처리되지 않은 plasmid와 foreign gene을 plasmid에 삽입하여 만든 inserted plasmid에 각각 제한효소를 처리하는 실험을 했다.
- 제한효소란 DNA의 특정한 염기서열을 인식하고 인식부위 또는 그 근처의 특정 이중사
DNAsub-cloning의 1단계: 원하는 유전자를 분리한다.
실험날짜 : 2011.10.24-28
실험목표 : DNA의 ligation/insertion process를 보고 그 결과를 확인한다. pET-14b vector에 antibiotic resistant 한 gene을 ligation 시키고, 후에 그 DNA를 component cell에 다시 삽입하여 ampicillin을 통해서 제대로 target gene이 삽입되었는지를 관찰하는 것
DNA분자를 recombinant DNA(재조합DNA)라고 한다.
4. 재조합 DNA를 시험관으로 이동: DNA 복제를 위한 효소 장치를 제공하는 숙주세포로 이동시킨다.
5. 재조합 DNA가 들어 있는 숙주세포를 선택 또는 확인: 항생제 내성을 이용해서 원하는 유전자를 선별한다.
Ι. DNAsub-cloning 의 1단계 : 원하는 유전자를 분리한
DNA electrophoresis(agarose gel)
(1) 기본원리
DNA gel 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 전기영동에 사용되는 buffer에서 음전하를 띄고 있으며 두 전극 사이에 위치했을 때 양극 쪽으로 움직이게 되는 기본원리를 갖는다. 이때 DNA분자가 gel matrix사이를
3. Definition (1) DNA: deoxyribonucleic acid, basic unit of gene consisting of A, C, G, T생명체가 살아가는데 필요한 유전정보를 저장 (2) RNA: ribonucleic acid, consisting of A, C, G, U mRNA: 유전정보를 전달 (3) gDNA: genomic DNA, genome 전체가 지니고 있는 DNA (4) cDNA: complementary DNA, mRNA로부터 역전사반응에 의해 제조된 DNA ∴ exon은 가지지
2. 제한효소(restriction enzyme)에 의한 유전자의 분리
유전자 클로닝은 DNA분자를 아주 정확하고 반복적으로 절단할 것을 요구한다. 각 Vector 분자의 circle을 열어서 새로운 DNA가 삽입될 수 있도록 각 분자마다 하나의 같은 위치가 절단되어야 한다. DNA를 자른다는 것은 nucleotides를 연결하고 있는 phosphodiester b